本发明涉及一种肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用。包括依次连接的启动子、目的基因、接头、第一自杀基因、第二自杀基因和终止子；其中，所述目的基因为黑色素瘤分化相关基因7，所述接头为P2A肽基因序列，所述第一自杀基因为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因，所述第二自杀基因为胞嘧啶脱氨酶基因。本发明不仅联合了具有极强抗肿瘤能力的mda‑7及双自杀融合基因TK‑CD，增强了抗肿瘤活性，能有效识别肿瘤位点，而且通过P2A肽基因序列将其连接，使得到的肿瘤特异性基因表达盒或含有该肿瘤特异性基因表达盒的重组表达载体具有很高的转录活性，能够高效地表达，为肿瘤的治疗提供了新的途径

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