本发明公开了一种双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用，属于基因工程技术领域。该表达载体包含核基质结合区序列、内核糖体进入位点序列和筛选标记，通过在启动子与IRES序列之间插入目的基因，可构成目的基因‑IRES序列‑筛选标记基因依次连接的双顺反子序列。表达载体的结构为：MAR‑启动子‑目的基因‑IRES序列‑筛选标记‑PolyA‑MAR。该载体利用一个启动子实现目的基因和筛选标记的同时表达，可减少由于不同表达框存在导致的假阳性细胞克隆，提高阳性细胞克隆筛选率，并克服传统载体目的基因与筛选标记表达不均衡的问题；载体上包含MAR序列能克服转基因沉默，实现转基因在宿主细胞中的高效、长期表达。

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